五月登陆与六月筑垒
苏珊·康斯坦特号、上帝恩赐号和发现号把殖民者及船员带到切萨皮克湾。乔治·珀西的亲历记载称，船队于4月26日进入海湾，随后沿河勘察。5月13日，他们来到最终驻地；14日全体上岸，一部分人修筑防御设施，另一部分站岗。因此选址、登陆开工和堡垒完成是相继发生的几个步骤。
这里靠近深水航道，船只可直接泊近岸边；三面环水和远离海口的位置，有利于防备西班牙袭击。珀西提到，他们曾看中另一处土壤较好的地点，却因船舶无法贴岸停泊而放弃。运输与防御的便利压过了其他考量。
6月15日，三角形堡垒完工，三个角各有炮台。由英格兰方面指定的理事会主持殖民地事务，爱德华·玛丽亚·温菲尔德成为首任主席。6月22日，纽波特船长返航，留下的殖民者开始在补给紧张的情况下独自维持据点。
交涉、冲突与粮食
英格兰人遇到的不是无人管理的河谷。珀西记录了帕斯帕赫及其他地方首领的迎接、赠食和交涉，也记下有人持弓要求他们离开。建立堡垒后，一次斧头争执发展为肢体冲突；另一些来访者仍带来鹿肉。不同地方群体的行动，以及同一群体在不同时刻的反应，都有所变化。
这些记述带有殖民者的猜疑和宗教偏见。珀西承认自己难懂当地讲话，却多次断定对方暗怀敌意；他又明确承认，居民后来送来的面饼、玉米、鱼和肉使虚弱的移民得以存活。贸易、馈赠与武装戒备同时存在，英国王室的纸面授权也没有使殖民者自动取得对周围社会的控制。
疾病、墓葬与延续
1607年夏秋，粮食不足、守卫劳累和疾病接连夺走移民生命。珀西逐日记录死者，并描述饮水涨潮时咸、退潮时混有污泥的状况。温菲尔德在9月被撤换，约翰·拉特克利夫继任主席，生存危机也伴随领导层争执。
堡内早期墓地为高死亡率提供了实物证据。考古人员发现的墓穴早于约1611年的联排建筑，其中有双人和三人合葬。研究者把部分墓葬暂定于1607年，并将堡墙内埋葬与公司要求隐瞒人员损失的命令联系起来。这些是结合地层和文献的解释，并非每座墓都已有确切身份。
詹姆斯敦此后仍经历严重饥荒和几乎撤离的危机，靠补给及后续移民才延续下来。1607年的建立，使英格兰在当地取得一个持续经营的立足点；它尚不是后来形成的烟草经济和殖民地议会制度。