教会书院与新式教育需求
东吴大学堂的筹办建立在监理会已有学校之上。苏州博习书院偏重以中文开展普通教育和教会人才训练；上海中西书院强调中西课程并重；孙乐文在苏州宫巷开办的中西书院，则吸引了甲午战争后希望学习英语与西学的青年。这些学校各有生源与教学积累，为办大学提供了人员和设施。
1898年底，监理会决定停办博习书院，把财产设备移交宫巷中西书院，并将部分学生转往上海。1899年，教会讨论以苏州的一所大学统领其他中小学。天赐庄既有校舍，又接近教会医院等机构，便于扩大校园；当地官绅的支持也是筹办者看重的条件。
董事会、购地与募款
1900年5月13日，监理会任命大学董事，林乐知任主席，孙乐文、潘慎文、柏乐文等参与筹建。办校事务分工推进：林乐知联系地方当局，柏乐文向江南各地人士募款，孙乐文等负责学校事务。大学既依托美国教会，也需要在中国取得办学空间和社会支持。
筹办者与江苏巡抚鹿传霖等官员商谈购地，并在苏关公署向官绅、学界和商界人士说明计划。在中国募集款项之外，监理会还在美国募资；1901年新奥尔良传教大会上的募款继续支持大学建设。经费因此来自跨国教会网络和地方社会，旧书院的校产、设备也被纳入新校。
天赐庄开办与校园扩建
1901年春，宫巷中西书院迁至天赐庄，东吴大学堂正式开办，孙乐文任首任校长。初期主要承接中学程度的教学，1905年才开设大学课程、招收大学学生。筹建时提出的多学科大学目标，是在此后的招生、增聘教师和增建校舍中逐步落实的。
天赐庄的校舍也并非同时建成。作为主楼的林堂以林乐知命名，配置教室与礼堂，后来又有纪念孙乐文的孙堂等建筑陆续加入。文物调查指出，主要建筑沿中轴线布置，校园经过多年扩建形成完整格局。这种空间变化与学校由旧书院走向大学的过程相伴。
语言训练与科学课程
早期教学把英语视为学习西方科学的重要工具，同时保留中国语言文化课程。学生先在中学或预科阶段加强语言基础，进入较高阶段后使用英文教材学习相关学科。学校由中外教师共同承担教学，课程随师资和教学条件的增加逐步扩展。
自1902年起，学校尝试以动作和连贯情境帮助学生理解英文句子的教学法，减少逐句翻译的依赖。语言训练服务于后续科学学习，课程逐渐扩大到物理、化学、数学和其他文理学科。1911年，上海中西书院的师生并入东吴大学，进一步整合了两地教学资源。
校园刊物与后续沿革
教学之外，学校通过出版物传播知识。1903年的《雁来红》刊载校史、校园生活和讨论历史、科学的短篇文章；1906年创办的《东吴月报》，创刊号题名《学桴》，设置论说、学科、译丛等栏目，出现心理、地理和化学等内容。师生由此有了展示学习成果、讨论知识和进行翻译的公共园地。
1952年院系调整时，东吴大学文理学院与苏南文化教育学院、江南大学数理系合并组建苏南师范学院，同年改称江苏师范学院，1982年更名苏州大学。2015年《苏州大学章程》追述1900年创办的东吴大学堂为前身，说明今日学校的沿革包含后续合并与重组，早期大学堂则是其中的重要来源。